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    原代細胞培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的方法

    發(fā)布時間: 2021-07-07  點擊次數(shù): 1345次
    原代培養(yǎng)
    原理
    將動物機體的各種組織從機體中取出,經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用 EDTA)或機械方法處理,分散成單細胞,置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細胞得以生存、生長和繁殖,這一過程稱原代培養(yǎng)。
    儀器、材料及試劑
    儀器:培養(yǎng)箱(調(diào)整至 37℃),培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱(37℃)
    材料:動物組織塊
    試劑:1640 培養(yǎng)基(含 20%小牛血清或胎牛血清),0.25%胰酶,Hank′s 液,碘酒
     
    初代消化培養(yǎng)法
    1. 準備:取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面,紫外線消毒 20 分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
    2. 布局:點燃酒精燈,安裝吸管帽。
    3. 處理組織:把組織塊置于燒杯中,用 Hanks 液漂洗 2~3 次,去除血污;如懷疑組織可能污染,可先置于含有青鏈霉素的混合液中 30~60 分鐘。
    4. 剪切:用眼科剪把組織切成 2~3 毫米大小的塊,以便于消化。加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角燒瓶中,結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。
    5. 消化:或用恒溫水浴,或置于 37℃溫箱消化均可,消化中每隔 20 分鐘應(yīng)搖動一次,如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。
    6. 分離:在消化過程中見消化液發(fā)混濁時,可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察,如組織已分散成細胞團或單個細胞,立即終止消化,隨即通過適宜不銹鋼篩,濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速(500~1000 轉(zhuǎn)/分)離心消化液 5 分鐘,吸出上清,加入適量含有血清的培養(yǎng)液。
    7. 計數(shù):用計數(shù)板計數(shù),如細胞懸液細胞密度過大,再補加培養(yǎng)液調(diào)整后,分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細胞來說,pH 要求在 7.2~7.4 范圍,培養(yǎng)液呈微紅色,如顏色偏黃,說明液體變酸,可用NaHCO3 調(diào)整。
    8. 培養(yǎng):置于 36.5℃溫箱培養(yǎng),如用 CO2 溫箱培養(yǎng),瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞,紗布塞易生霉菌,每次換液時需要換新塞。
     
    初代組織塊培養(yǎng)法
    1. 剪切:把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中,用 Hanks 液漂洗二三次以去掉表面血污,吸靜 Hanks 液,用眼科剪反復(fù)剪切 1mm3 塊為止。
    2. 擺布:用彎頭吸管吸取若干小塊,置于培養(yǎng)瓶中,用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部,小塊相互距離以 0.5cm 為宜,每一 25ml 培養(yǎng)瓶底可擺布 20~30 塊。
    3. 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,另瓶底向上,注意翻瓶時勿另組織小塊流動,塞好瓶塞,置 36.5℃溫箱培養(yǎng) 2 小時左右(勿超過 4 小時),使小塊微干涸。
    4. 培養(yǎng):從微箱中取出培養(yǎng)瓶,開塞,46 度斜持培養(yǎng)瓶,箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許,然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來,讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。
     
     
    傳代培養(yǎng)法
    原理
    細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后,已基本上飽和,為使細胞能繼續(xù)生長,同時也將細胞數(shù)量擴大,就必須進行傳代(再培養(yǎng))。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以,而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
    材料和試劑
    1. 細胞:貼壁細胞株
    2. 試劑:0.25%胰酶、1640 培養(yǎng)基(含 10%小牛血清或胎牛血清)
    3. 儀器和器材:倒置顯微鏡,培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等
     
    操作步驟
    1. 吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
    2. 向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶和 EDTA 混合液少許,以能覆滿瓶底為限。
    3. 置溫箱中 2~5 分鐘,當發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮,細胞間隙增大后,立即終止消化。
    4. 吸除消化液,向瓶內(nèi)注入 Hanks 液數(shù)毫升,輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,把殘余消化液沖掉。注意加 Hanks 液沖洗細胞時,動作要輕,以免把已松動的細胞沖掉流失,如用胰蛋白酶液單獨消化,吸除胰蛋白酶液后,可不用 Hanks 液沖洗,直接加入培養(yǎng)液。
    5. 用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細胞,使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。
    6. 計數(shù)板計數(shù)后,把細胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中,置溫箱中培養(yǎng)。
     
    無菌操作注意事項
    1. 操作前要洗手,進入超凈臺后手要用 75%酒精或 0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
    2. 點燃酒精燈,操作在火焰附近進行,耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時間不能太長,以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。
    3. 操作動作要準確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動,增加污染機會。
    4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。
    5. 瓶子開口后要盡量保持 45℃斜位。
    6. 吸溶液的吸管等不能混用。
     
     
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