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    避免踩坑,注意別踩DNA測(cè)序里的大坑!

    發(fā)布時(shí)間: 2021-08-27  點(diǎn)擊次數(shù): 7167次

    DNA 測(cè)序技術(shù)自從發(fā)明以來(lái),作為一種重要的分子生物學(xué)手段,正在科研和臨床上得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。下面,介紹一下DNA測(cè)序里的大坑。給大家一個(gè)前車(chē)之鑒吧。


    坑一:信號(hào)衰減/中斷

    測(cè)序信號(hào)衰減和中斷,是測(cè)序過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題,原因多種多樣:模板中含有重復(fù)序列,模板中含有高級(jí)結(jié)構(gòu),模板中 GC 含量過(guò)高等,都會(huì)使得測(cè)序信號(hào)衰減和中斷。另外,引物的質(zhì)量不好,試劑失活了,都會(huì)造成這種問(wèn)題。解決的方法:反其道而行之,采用反向引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序,然后通過(guò)序列拼接獲得全長(zhǎng)。有時(shí)候就象做拼圖游戲。大家 have fun 吧。這里,教大家一個(gè)小竅門(mén):在這個(gè)過(guò)程中,可以適量地加入 DMSO,并且進(jìn)行擴(kuò)增。


    坑二:重疊峰/亂峰

    這個(gè)問(wèn)題一般是由于序列前面有連續(xù)的堿基,或者是引物的堿基缺失了。如下圖所示,模板中有單一位點(diǎn)的堿基缺失,堿基缺失導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果移碼。

    避免踩坑,注意別踩DNA測(cè)序里的大坑!

    現(xiàn)在有很多測(cè)序公司,號(hào)稱(chēng)可以幫助設(shè)計(jì)引物;號(hào)稱(chēng)引物是 PAGE 級(jí)別的。這里,嚴(yán)重不推薦哈。最好還是自己動(dòng)手,豐衣足食。解決辦法:自己設(shè)計(jì)引物;自己合成引物;自己將引物進(jìn)行 PAGE 純化。反正就是掌握一個(gè)原則:自己動(dòng)手,豐衣足食。


    坑三:Ploy 結(jié)構(gòu)

    有的時(shí)候,我們會(huì)遇到 Poly 結(jié)構(gòu),就是 G/C rich,G/C Cluster,Poly A,Poly T 結(jié)構(gòu)等。這種結(jié)構(gòu)的測(cè)序容易出現(xiàn)移碼現(xiàn)象,導(dǎo)致測(cè)序信號(hào)衰減和中斷(如下圖)。解決方法:還是反其道而行之。采用反向引物對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序,測(cè)到該 poly 結(jié)構(gòu)處,進(jìn)行拼接,不就可以獲得序列全長(zhǎng)嘛。

    避免踩坑,注意別踩DNA測(cè)序里的大坑!


    坑四:空載體

    原因?yàn)椋耗康钠尾迦胧。蛘吲囵B(yǎng)過(guò)程中目的片段丟失。解決方案:重起爐灶。重新挑選單克隆,進(jìn)行 PCR 后,再送去測(cè)序。


    坑五:測(cè)序結(jié)果和文獻(xiàn)資料不一樣

    這個(gè)會(huì)以為是實(shí)驗(yàn)?zāi)睦锍鰡?wèn)題了,或者是測(cè)序公司那里出問(wèn)題了。這個(gè)問(wèn)題是沒(méi)有辦法滴。同一種動(dòng)物,不同的種族,甚至不同的個(gè)體,基因序列都不一定*一樣。如果是 PCR 產(chǎn)物克隆測(cè)序,那還有 PCR 過(guò)程中的錯(cuò)配因素等等。

    一般比較正規(guī)的測(cè)序公司,提供的測(cè)序結(jié)果都是忠實(shí)結(jié)果,和文獻(xiàn)序列不一樣,也就只好不一樣啦。


    坑六:重復(fù)序列

    如下圖所示,好看吧?好看是好看,但是真的看到這個(gè)結(jié)果,可能就要哭鼻子了。可能的原因:樣品中就含有重復(fù)序列,結(jié)果導(dǎo)致:測(cè)序結(jié)果和 Poly A/T 的結(jié)果一樣。這也會(huì)導(dǎo)致 Frame 滑動(dòng),結(jié)果出現(xiàn)移碼。

    避免踩坑,注意別踩DNA測(cè)序里的大坑!


    解決辦法: 還是反其道而行之,反向測(cè)序。有時(shí)能夠順利的通過(guò)重復(fù)序列區(qū)域,但是有時(shí)候又不一定能夠。全靠運(yùn)氣吧。如果能夠的話,通過(guò)多次的測(cè)序結(jié)果比對(duì),還是做拼圖游戲吧,拼接可以得到全序列結(jié)果。

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