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    CO-IP沒有條帶的常見原因和解決的辦法

    發(fā)布時間: 2021-09-13  點擊次數(shù): 5776次

    CO-IP 并不容易做,尤其是兩個蛋白豐度低,相互作用力較弱的時候。做 CO-IP 經(jīng)常會遇到?jīng)]有條帶的問題。這里談談 CO-IP 沒有條帶的常見原因和解決的辦法,更有獨門配方獻上。


    蛋白濃度過稀 

    絕大多數(shù)情況下,CO-IP 沒有條帶是由于蛋白濃度過稀。裂解產(chǎn)物的蛋白濃度越高越好。但是,有些實驗室喜歡稀釋裂解樣品的蛋白濃度再做 CO-IP。其實,在大多數(shù)情況下要盡可能避免稀釋你的細胞裂解液。盡量使細胞裂解產(chǎn)物的蛋白濃度可達 7-8 mg/ml 左右。這才會避免發(fā)生沒有條帶的情況。


    沒有裂解開 

    很多時候,由于裂解液不夠強烈,蛋白質(zhì)復合物沒有分開,也會造成沒有條帶的問題。解決辦法是:加溫和加少量的 SDS 增加變性能力。這里再介紹一個小竅門:最初幾遍的漂洗 buffer 要和 IP 時的鹽濃度相同。純化蛋白的時候,如果用低鹽裂解細胞,高鹽漂洗去雜質(zhì),蛋白丟失較多。再奉獻一個獨門配方:20 mM Tris/HCl,pH7.6,100 mM  NaCl,20 mM KCl,1.5 mM MgCl2,0.5% NP-40 and protease inhibitors (0.5M PMSF)。包用包好。


    量不合適

    很多時候,CO-IP 沒有條帶,是由于蛋白量,珠子,抗體的量需要調(diào)整。根據(jù)經(jīng)驗,一般 100ug 蛋白,3ug 抗體,30ug 珠子。如果不行,250ug 蛋白,5ug 抗體,或者 500ug 蛋白,7ug 抗體。


    抗體太坑

    抗體是 CO-IP 成敗的致命因素之一!必須是 IP 級別的抗體。說句不好聽的話,不要用國產(chǎn)抗體和 Santa Cruz 的抗體。這些抗體在做 CO-IP 的實驗室里面已經(jīng)臭名遠揚了。坑人無數(shù)。大家就不要再重蹈覆轍了。 

    單抗與多抗的選擇也需要仔細考慮。兩種抗體各有利弊。單抗特異性強,背景低。但是單抗有一個致命的弱點,就是識別位點單一,而在 CO-IP 過程中,該位點很有可能與其它蛋白或核酸結合而被封閉,導致單抗不能識別靶蛋白而沒有條帶。所以,如果沒有十足把握,單抗的識別位點遠離靶蛋白與核酸結合的區(qū)域,還是選擇多抗比較穩(wěn)妥一些。至少不會出現(xiàn)沒有條帶的問題。


    細胞數(shù)量太少 

    很多時候,CO-IP 沒有信號是由于細胞數(shù)量太少。一般是 145 mm 的培養(yǎng)皿,至少要長到 50%以上。如果低于這個數(shù)目,CO-IP 就很有可能沒有信號。除非藥品和試劑非常非常昂貴,否則就不要節(jié)約這點細胞了。一旦 CO-IP 實驗失敗,浪費的時間可是更寶貴的。


    綜上所述,CO-IP 是比較難做的一個實驗。很多時候,能否成功取決于抗體和兩個蛋白的結合常數(shù),和 protocol 和實驗操作本身的關系不大。以上,介紹了一些經(jīng)驗體會和小技巧小竅門,希望對大家有所幫助。


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