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    蛋白樣品的制備與定量

    發(fā)布時間: 2021-09-14  點擊次數(shù): 2322次

    (1)提細胞蛋白 

    ① 消化或刮下細胞至 1.5 的 EP 管中,標記,10000r 離心 2min,PBS 洗 3 遍

    ② 吸去 EP 管中 PBS,最好用濾紙吸干里面的水分,加適量 RIPA 裂解液(RIPA 裂解液:蛋白酶抑制劑=250:1),如果你想做信號通路指標還得再加上磷酸酶抑制劑(磷酸酶抑制劑: RIPA 裂解液=1:1000) 

    ③ 冰上裂解 30min~1h,開 4°離心機 

    ④ 4°離心 11000r,20min 

    ⑤ 測蛋白濃度,取上清,加蛋白上清的四分之一體積 5x 上樣 loading buffer,煮沸,分裝(蛋白質(zhì)變性)


    (2)提組織蛋白 

    ① 研缽中倒入液氮,加入組織塊,研磨,加液氮,藥匙刮 

    ② 刮下后放入 1.5ml 的 EP 管,加適量裂解液,吹打 

    ③ 冰上放置 1h,期間,每隔 10~15min 吹打一次,開 4°離心機 

    ④ 4°離心 10000r,1h 

    ⑤ 測蛋白濃度,取上清,加 1/4 體積 5x loading buffer,煮沸,分裝


    (3)測蛋白濃度(BCA 法) 

    ① 八個標準孔,按說明書先加超純水,再加標準蛋白液 

    ② 目的孔,每孔加 18ul 超純水+2ul 目的蛋白 

    ③ 按說明書配 BCA 工作液,每孔加 200ul 

    ④ 37°放置半小時后測濃度


    (4)計算上樣量,設計上樣順序 

    上樣體積:上樣量/濃度 x 5/4

    上樣順序:無處理,對照,處理;體積最好不要相差太大


    經(jīng)驗總結(jié): 

    如何提高蛋白濃度:首先當然是多種點細胞啦,其次可以少加點裂解液,盡量裂解充分。如何處理蛋白濃度低的問題:實驗過程中發(fā)現(xiàn)蛋白的濃度太低,如果上樣的話,體積太大,甚至電泳孔都裝不下,舉例:假設我需要上樣 40ul 才能達到 20ug,那么顯然按照常規(guī)的方法,10 孔的梳子只能加 25ul 左右,我們此時可以取 40ul 蛋白入 EP 管中,放置于 PCR 儀器,變性溫度濃縮蛋白體積,這樣不斷濃縮之后促使 EP 管中蛋白的水分降低,蛋白量依舊是 20ug。如何保證對照組和實驗組蛋白濃度大概是一致的:種植細胞的時候盡量保持鋪下去的細胞數(shù)接近,收細胞之后觀察細胞的多少適當加入幾倍體積的裂解液。 


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