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    實時熒光定量PCR的優(yōu)化(一)

    發(fā)布時間: 2021-10-12  點擊次數(shù): 1911次
    如果是病毒定量和SNP基因分型的實時熒光定量PCR,我們需要盡可能高特異性;如果是病原體、mRNA檢測,我們需要高靈敏度。


    想要提高PCR擴(kuò)增效率、特異性及靈敏度,我們可以通過一系列措施優(yōu)化實時熒光定量PCR實驗。首先是靶序列的選擇。


    1、選擇的靶序列合適長度在50~150bp之間。較短的序列合成耗時短,擴(kuò)增時間縮短,因此污染DNA被擴(kuò)增的可能性降低。

    2、選擇靶序列時,使用BLAST檢索分析靶序列是否存在多態(tài)性和測序錯誤,并避開。如果靶序列中出現(xiàn)重復(fù)序列,會降低PCR檢測靈敏度,也應(yīng)該避開。

    3、控制靶序列中GC含量≤60%。高GC含量,會影響靶序列在熱循環(huán)中的變性,也容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。

    4、避免產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)。靶序列如果有反向重復(fù)的序列,容易產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu),影響引物、探針的雜交。

    除此以外,我們還需要保證模板的質(zhì)量不會影響擴(kuò)增,實時熒光PCR的結(jié)果才有可靠性。例如損傷的DNA在PCR中不能充分?jǐn)U增,或者根本不能擴(kuò)增。同時,如果模板中存在抑制DNA聚合酶的試劑(DMSO等)和污染物(SDS等),也會影響PCR的可靠性。



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