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    如何做核提取物制備優(yōu)化?

    發(fā)布時間: 2021-11-24  點(diǎn)擊次數(shù): 970次

    材料與儀器

    轉(zhuǎn)瓶或單層培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞(如HeLa細(xì)胞)
    高鹽緩沖液 分別含 0.8、1.0、1.2、1.4 及 1.6 mol L KCl
    貝克曼 JS4. 2 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子 50 mL 圓錐形刻度聚丙烯離心管(對較小體積的提取物也可用 15 mL 的離心管) Dounce 氏玻璃勻漿器(B 型研杵) Beckman JA-20 離心轉(zhuǎn)子或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子磁性攪拌器或傾斜臺 管型透析膜(14000 MWCO) 電導(dǎo)計(jì)

    步驟


    1)按基本方案中步驟1?8操作。


    2)在低鹽緩沖液中重懸細(xì)胞核后(1/2體積pnv,見基本方案步驟8),將細(xì)胞核懸液分成5等份。


    3)在冷室內(nèi)不斷攪拌,按如下方法在每份懸液中加入1/3體積高鹽緩沖液:在第1份 中加KCl濃度低至(0.8 mol/L)的高鹽緩沖液,其余各份中依次加入KCl濃度逐 漸增高(直到1. 6 mol/L)的高鹽緩沖液。


    4)確定在離心管斜面上有提取出的細(xì)胞核,輕輕混合30 min。


    5)25000 g離心30 min,除掉核。


    6)將上清輕輕倒出,進(jìn)行透析(見基本方案步驟12),直到加KCl濃度最高的那份核懸液的電導(dǎo)率達(dá)到與透析液一致(100 mmol/L KCl)。提取物25000 g離心20 min。


    7)檢測各份提取物的電導(dǎo)率并測定蛋白質(zhì)濃度(見基本方案步驟13和14)。


    8)直接分析提取物或分裝到試管中,在液氮中速冷后放入-80℃保存。



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