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    角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

    發(fā)布時間: 2022-12-07  點(diǎn)擊次數(shù): 821次

    原理

    將角膜組織置于膠原蛋白上,使其附著。然后,在涂有纖連蛋白和膠原蛋白的培養(yǎng)皿擴(kuò)增培養(yǎng)。

    材料與儀器

    D-PBSA 無血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液 胰蛋白酶 EDTA Biocoat6孔培養(yǎng)板

    步驟

    一、材料

    滅菌

    無血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液(keratinocyteserum-freemedium,KGM;Clonetics): 含有 0.15 mmol/LCa2-、0.1ng/ml 人上皮生長因子、5ug/ml 胰島素、0.5ug/ml 氫化可-的松和 30ug/ml 牛垂體提取物。

    EMEM(Eagle'sminimalessentialmedium)

    D-PBSA:不含 Ca2+和 Mg2+的 DulbeccoPBSA 液 FBS

    胰蛋白酶和 EDTA 混合液:0.05% 胰蛋白酶,0.5 mmol/L EDTA
    纖連蛋白和膠原蛋白混合液(fibronectin/collagen,F(xiàn)NC):10ug/ml 纖連蛋白、35ug/ml 膠原蛋白和 lOOug/mlBSA。BSA 作為穩(wěn)定劑

    Biocoat 6 孔培養(yǎng)板:涂有鼠尾 I 型膠原蛋白(B-D Biosciences)

    二、操作步驟 

     

    原代培養(yǎng) 


    1. 將供體角膜放于消毒過的物品上,上皮面朝上,用手術(shù)刀切成 12 個三角形組織片。應(yīng)一刀切下去,避免鋸割。如此仔細(xì)處理角膜可減少對膠原蛋白基質(zhì)的破壞和成纖維細(xì)胞的脫落。


    2. 將角膜組織片的上皮面翻向下,放入用鼠尾 I 型膠原蛋白預(yù)涂的 6 孔培養(yǎng)板,每孔放 4 個組織塊。


    3. 用鑷子輕壓組織片,以便使組織塊與培養(yǎng)皿表面充分接觸。將組織片放置 20 min,使其變干。


    4. 將一滴 KGM 輕輕滴于組織片上,在 37°C 和 5%CO2 條件下孵育過夜。盡管從眼庫得到的供體角膜是用含有抗菌素的培養(yǎng)液(McCarey-Kauffman 或 Dexsol) 保存的,但全部操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。


    5. 第 2 天,在培養(yǎng)皿中加人 lml 培養(yǎng)液。在培養(yǎng)早期,可觀察到細(xì)胞僅從角膜緣處遷出,但沒有細(xì)胞從角膜中央部或鞏膜遷出。無血清培養(yǎng)液含有低濃度鈣(0.15 mmol/L),減少膠原蛋白基質(zhì)降解,故這種培養(yǎng)液可減少成纖維細(xì)胞長出。


    6 在植入角膜組織片后第 5 天,用鑷子將組織片取出,再加人 3 ml 培養(yǎng)液。取出組織片后,貼壁細(xì)胞繼續(xù)增殖。培養(yǎng)后第 2 周,細(xì)胞生長形成單層,呈現(xiàn)上皮具有的典型卵石狀排列特征。每個角膜約獲得 1X106?5X106 個上皮細(xì)胞。

     

    擴(kuò)增培養(yǎng)

     

    7. 取出組織片后,每周換液 2 次。

     

    8 當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá) 70%?80% 時,用 D-PBSA 浸洗細(xì)胞。然后,在 37°C 條件下用胰蛋白酶和 EDTA 混合液處理 4 min。

     

    9. 用含有 10% FBS 的 D-PBSA 終止消化。

     

    10 將細(xì)胞離心后,用 KGM 混懸。計數(shù)細(xì)胞,以 1X104 個/cm2 密度將細(xì)胞接種于涂有 FNC 的培養(yǎng)皿。

     

    11 在 37°C、95% 空氣和 5%CO2 條件下培養(yǎng)。

     

    12. 胰蛋白酶處理和種植 1d 后換培養(yǎng)液。

    傳代后不久,上皮細(xì)胞呈長梭形,折光,遷移能力較強(qiáng)。傳代后第 1 周,細(xì)胞匯合達(dá) 70%?80% 時呈卵石狀排列。如果形成單層后繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞能生長成散在的復(fù)層結(jié)構(gòu)。

    盡管角膜上皮細(xì)胞能傳至 5 代,約倍增 9?10 倍,但大多數(shù)細(xì)胞增殖發(fā)生在第 1?3 代。每個角膜約獲得 1X106?2X106 個上皮細(xì)胞。細(xì)胞常在第 5 代開始衰老。


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