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    小鼠MSC細(xì)胞的提取操作

    發(fā)布時(shí)間: 2023-01-04  點(diǎn)擊次數(shù): 1561次

          MMSC細(xì)胞一般采用,長(zhǎng)骨解剖和骨髓分離程序,總體目標(biāo)是快速、系統(tǒng)地取出長(zhǎng)骨,并收集骨髓細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。這種方法有助于回答有關(guān)骨髓生物學(xué)、腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫學(xué)的關(guān)鍵問(wèn)題。這項(xiàng)技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是解剖過(guò)程快速、標(biāo)準(zhǔn)化,骨髓分離程序相當(dāng)無(wú)菌,首先處死小鼠并將小鼠置于仰臥位。

          然后將小鼠的四個(gè)爪墊固定在踝關(guān)節(jié)下方,用70%乙醇噴灑小鼠,徹-底沖洗腿部。下一步,在臀部正上方的下腹部中線(xiàn)右側(cè)做一個(gè)小切口,將切口向下延伸到腿部,穿過(guò)踝關(guān)節(jié)。拉回皮膚。

          然后切開(kāi)固定在股骨近端的股四頭肌,露出大腿骨的前側(cè),并用銷(xiāo)釘將肌肉從腿部固定出來(lái),與木板成45度角。用剪刀抵住股骨后側(cè),從膝關(guān)節(jié)上剪下腘繩肌。然后將固定在股骨近端的皮膚和腘繩肌向后拉,露出骨的后側(cè),并將腘繩肌從腿部固定出來(lái),使固定銷(xiāo)成45度角。

     

          用鑷子抓住股骨遠(yuǎn)端,剛好在膝關(guān)節(jié)上方。然后引導(dǎo)股骨干兩側(cè)的剪刀刀片朝向髖關(guān)節(jié)。到達(dá)股骨頭后,扭轉(zhuǎn)剪刀,將頂部刀片直接移到股骨頭上方,使股骨脫臼。

     

         用鑷子抓住股骨干的頂部,從股骨頭上切下軟組織,將股骨從髖臼中取出。然后將整個(gè)腿骨,包括股骨、膝蓋和脛骨向上拉離身體,小心地切斷連接腿部與皮膚的結(jié)締組織和肌肉。當(dāng)所有的結(jié)締組織都被移除后,拉伸踝關(guān)節(jié)并扭轉(zhuǎn)剪刀,使脛骨脫臼。

     

          抓住脛骨遠(yuǎn)端,注意不要切斷肌腱,將脛骨向上拉離身體和釘板。然后去除任何殘留在膝蓋長(zhǎng)骨上的結(jié)締組織,以及任何附加在股骨和脛骨上的肌肉或結(jié)締組織。抓住股骨,使髕骨朝外,股骨頭朝下。

     

          過(guò)度伸展膝關(guān)節(jié),扭動(dòng)剪刀,使脛骨與股骨脫臼。然后移除所有連接股骨和脛骨的結(jié)締組織。下一步,抓住股骨,使前側(cè)朝外,股骨頭朝下,然后將剪刀沿股骨干向上引導(dǎo)至髁部。

     

          輕輕地來(lái)回旋轉(zhuǎn)剪刀,去除髁突、髕骨和骨骺,露出干骺端。然后,用鑷子、剪刀和低塵擦拭紙去除任何附加在股骨上的肌肉或結(jié)締組織。下一步,抓住脛骨,前側(cè)朝外,踝端朝下。

     

          如果脛骨骨骺完好無(wú)損,將剪刀沿脛骨軸向上引至髁突處,輕輕來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)剪刀,將髁突和骨骺切除,露出脛骨干骺端。然后移除任何附加在脛骨上的肌肉或結(jié)締組織,如剛才所示。為了獲取骨髓,首先用一根18號(hào)的針穿過(guò)一根0.5毫升的微量離心管的底部。

     

         然后把長(zhǎng)骨放進(jìn)管子里,膝蓋朝下,蓋上蓋子。將0.5毫升的微型離心管放入1.5毫升的微型離心管中,并在大于或等于10000倍g的微型離心管中離心15秒。通過(guò)目視檢查確認(rèn)骨髓已經(jīng)從骨頭中旋出。

     

    •使用10mL注射器,抽出骨髓細(xì)胞

     

    •轉(zhuǎn)移至50mL錐形管中,用FSB將體積增加至50mL

     

    •將50uL樣品轉(zhuǎn)移到eppendorf試管中,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)

     

    •以1200轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)細(xì)胞8分鐘

     

    •從離心細(xì)胞中倒出上清液,轉(zhuǎn)入干細(xì)胞完-全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)

      MMSC-bm第一天.png           MMSC-BM.png

           正常培養(yǎng)第一天                    正常培養(yǎng)第三天

    提取的小鼠的MMSC-bm             

    間充質(zhì)干細(xì)胞完-全培養(yǎng)基進(jìn)行純化和培養(yǎng)。


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