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    RT-PCR的無擴增產(chǎn)物

    發(fā)布時間: 2023-06-30  點擊次數(shù): 766次

    可能原因 1:引物問題(包括:引物設(shè)計較差,引物合成較差,引物濃度太低)。

    解決方法:設(shè)計引物的時候,避免在引物 3'端含有互補序列;避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列;設(shè)計 Tm 類似的引物。針對引物合成的問題,用普通電泳法,看引物的設(shè)計和合成質(zhì)量,是否有目的條帶出現(xiàn)。最佳引物濃度介于 0.1μM 到 0.5μM 之間。

    可能原因 2:探針問題。

    解決辦法:就要用到我們前面提到的序列分析了。用 blast 對探針序列進行比對,設(shè)計符合要求的探針。

    可能原因 3:模板問題(包括:模板質(zhì)量不好,模板濃度太低)。

    解決方法:提高模板質(zhì)量。如果懷疑模板被 DMSO 等抑制劑污染了,堅決采用乙醇沉淀;使用 104copy 的靶序列,然后在 25 到 30 個循環(huán)中獲得信號。

    可能原因 4:不明物干擾。

    解決辦法:做 RT-PCR 必須非常小心翼翼。對 RT-PCR 的任何實驗樣品或試劑,均應(yīng)采用“三無"離心管(即無菌無酶無熱源)進行試劑的分裝和使用。

    可能原因 5:擴增酶問題。

    解決辦法:不要省錢。買好的擴增酶。分子生物學(xué)永遠是一分價錢一分貨。推薦:選擇hot start Taq 酶進行擴增,可提高靈敏度,增加產(chǎn)量,降低干擾因素。



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