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    酵母雙雜交(Y2H)實(shí)驗(yàn)操作指南

    發(fā)布時(shí)間: 2024-03-21  點(diǎn)擊次數(shù): 1216次

    酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two hybrid,Y2H) 常用于分析兩種蛋白質(zhì)的相互作用。將兩種蛋白質(zhì)分別克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活域(AD)上,構(gòu)建成融合表達(dá)載體,從而分析兩種蛋白質(zhì)的相互作用。


    pGBKT7是酵母雙雜交bait表達(dá)載體,旨在表達(dá)GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-BD,1-147 aa)與bait蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。pGADT7是酵母雙雜交表達(dá)載體,旨在表達(dá)GAL4激活結(jié)構(gòu)域(AD, 768-881 aa)與目的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。


    圖片

    一、酵母感受態(tài)細(xì)胞制備

    (1) 將-80℃保存的酵母菌株在YPDA固體培養(yǎng)基平板上劃線,30℃培養(yǎng)條件下倒置培養(yǎng)4-7d。

    (2) 挑取單菌落至含3mLYPDA液體培養(yǎng)液中。

    (3) 30℃培養(yǎng),200rpm 震蕩培養(yǎng)8h。

    (4) 當(dāng)菌液OD值約為0.3時(shí),轉(zhuǎn)移10uL菌液到含50mIYPDA培養(yǎng)液中。

    (5) 30℃培養(yǎng),200rpm震蕩培養(yǎng)16-20h至OD值為015-0.3。

    (6) 700g轉(zhuǎn)速5min室溫離心收集細(xì)胞。

    (7) 將底部沉淀使用已預(yù)熱至30℃的100mLYPDA中重懸酵母細(xì)胞。

    (8) 30℃,200rpm,搖3-5h至OD值=0.6時(shí)。

    (9) 5min室溫離心收集細(xì)胞。

    (10) 將底部沉淀在30mL無(wú)菌超純水中重懸酵母細(xì)胞.

    (11) 700g轉(zhuǎn)速5min室溫離心收集細(xì)胞。

    (12) 將底部沉淀加入3mL的1.1XTE/LiAc重懸細(xì)胞。

    (13) 將懸重懸細(xì)胞分成2管,6000g轉(zhuǎn)速室溫離心30s。

    (15) 將底部沉淀加入500uL的1XTE/LiAc重懸酵母細(xì)胞,分裝為100uL每管。

    二、轉(zhuǎn)化

    (1)在干凈的1.5 mL的離心管中并振蕩混勻。

    (2)每個(gè)離心管中加入100 µL的酵母感受態(tài)細(xì)胞,500 µL的PEG/LiAc溶液,加入兩種質(zhì)粒,并且將管中的混合物進(jìn)行旋渦振蕩,將其混勻。

    (3)在30℃,220 rpm/min的搖床振蕩培養(yǎng)30 min。

    (4)往每個(gè)離心管中加70 µL的DMSO,并溫和的上下顛倒混勻。將離心管在42℃水浴中熱激40 min(每隔10 min搖勻1次)。

    (5)取出離心管,在冰上靜置2 min。

    (6)吸取100 µL并涂布在相應(yīng)的二缺固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)3-4天,待菌長(zhǎng)好后,挑單菌落于10ulYPDA液體培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)過(guò)夜。

    互作驗(yàn)證:

    取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液涂布于四缺平板上,將培養(yǎng)皿置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察是否生長(zhǎng)與顏色變化。

    注意事項(xiàng):

    (1)檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞效率,標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范。

    (2)注意質(zhì)粒使用量,檢查儀器狀態(tài)。

    (3)配制新鮮培養(yǎng)基,并做對(duì)照轉(zhuǎn)化,添加抑制劑,同時(shí)增設(shè)嚴(yán)格的對(duì)照組防止自激活。

    (4)應(yīng)挑選大的、新鮮的菌株克隆進(jìn)行培養(yǎng)。

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