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    Dot blot法鑒定分泌型蛋白表達

    發(fā)布時間: 2024-04-10  點擊次數(shù): 472次

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    實驗原理:

    Dot blot是一種半定量的蛋白質(zhì)或核酸檢測方法,其原理是將待測物直接滴于固相載體上,然后通過特異性抗體或探針與待測物結(jié)合,最終通過可視化方法來檢測目標分子的存在與否。


    溶液配置:

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    操作步驟:

    (1)減取適當大小的PVDF膜,于甲醇活化1分鐘;


    (2)將活化后的PVDF膜于ddH2O中,在脫色搖床上清洗15分鐘;


    (3)提取預冷離心機,將樣品在4℃低溫條件下8000 rpm離心15分鐘,取上清作為樣品(分泌型蛋白)。


    (4)取出活化后的PVDF膜在室溫晾至半干,看見水膜消失即可。將收集的上清、空白對照、陽性對照分別取5ul點樣至PVDF膜上,風干。室溫待樣品吸收,樣品吸收后點樣處顏色加深。


    (5)封閉:待PVDF膜上樣品干燥后,于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉,37℃培養(yǎng)箱孵育2h或者4℃過夜孵育。


    (6)TBST清洗PVDF膜5次,每次5分鐘。


    (7)一抗孵育:用含5%脫脂奶粉的TBST溶液以1:10000的稀釋比稀釋一抗,37℃培養(yǎng)箱孵育2h或4℃過夜孵育。


    (8)TBST清洗PVDF膜5次,每次5分鐘。

    (9)二抗孵育:用含5%脫脂奶粉的TBST溶液以1:10000的稀釋比稀釋二抗,37℃培養(yǎng)箱孵育1.5 h。


    (10)TBST清洗PVDF膜5次,每次5分鐘。


    (11)曝光:用濾紙吸干PVDF膜上的TBST溶液,滴加ECL超敏顯色劑(A液:B液=1:1),提前將化學曝光儀預冷,進行曝光,觀察并記錄結(jié)果。


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