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    【RNA提取】RNA抽提的三大紀(jì)律八項(xiàng)注意!

    發(fā)布時(shí)間: 2021-08-30  點(diǎn)擊次數(shù): 3197次

    今天我們談一談 RNA 抽提的問題。為了方便大家記憶,總結(jié)出了“三大紀(jì)律八項(xiàng)注意"。


    紀(jì)律一:無(wú)外源酶的污染。 

    外源酶會(huì)造成 RNA 的降解,造成 RNA 得率太低,或者*失敗。而外源酶又是無(wú)處不在的。這就要求注意以下三點(diǎn):

    注意一:嚴(yán)格戴好口罩,手套。手指和呼吸時(shí)重要的外源酶的來(lái)源。所以童鞋們做 RNA 抽 提的時(shí)候,還是要全副武裝起來(lái)。這對(duì)自己也是一種保護(hù)措施。 

    注意二:實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管,槍頭,移液器,實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要*處理。離心管和槍頭要用 DEPC 處理過,單純的消毒滅菌可不行呀。移液器和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要用 75%的酒精擦過。 

    注意三:實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液,尤其是水,必須確保 RNase-Free。


    紀(jì)律二:無(wú)內(nèi)源酶的活性。 

    這個(gè)和紀(jì)律一是一脈相承的。目的都是減少 RNA 的降解,提高最終的得率。而所有的組織都含有內(nèi)源酶,這就要求我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中,千方百計(jì)滅活內(nèi)源酶。這也就誕生了下面的四大注意事項(xiàng): 

    注意四:選擇合適的勻漿方法。新鮮樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍,然后可以移至-70℃ 冰箱保存。在碾磨前,碾磨用具也必須預(yù)冷。在碾磨過程中,一邊碾磨,一邊補(bǔ)充液氮。樣品碾碎后,在液氮?jiǎng)倓倱]發(fā)完時(shí),將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中,立即混勻勻漿。

    注意五:選擇合適的裂解液。現(xiàn)在市場(chǎng)上常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性。但是,高內(nèi)源酶含量的樣品,如肝臟,脾臟等組織,建議使用含苯酚的裂解液。苯酚的滅活內(nèi)源酶的能力是很強(qiáng)的。 

    注意六:控制好樣品的起始量。如果樣品的塊頭太大,所有的細(xì)胞無(wú)法迅速和裂解液接觸。里面沒有接觸到細(xì)胞的 RNA 很快就會(huì)被內(nèi)源酶降解。所以,起始量不要太大。如果塊頭太大,要把它切成小塊小塊的。


    紀(jì)律三:明確抽提目的。 

    我們做每一個(gè)實(shí)驗(yàn),甚至每一個(gè)步驟,都要清楚這樣子做的目的是什么。RNA 用于不同的實(shí)驗(yàn),其質(zhì)量的要求是不一樣的。那么,這就誕生了下面的最后兩條紀(jì)律: 

    注意七:任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時(shí),抽提成功率急劇下降。所以,要進(jìn)行樣品的破碎和勻漿。其目的是為了使 RNA *地完整地釋放出來(lái)。如果樣品是細(xì)胞,則無(wú)須破碎即可直接勻漿;如果是組織,甚至器官,那就需要破碎后才能勻漿;如果是酵母菌和細(xì)菌,則需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。

    注意八:RNA 抽提成功的一個(gè)經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一次成功,而不是得率。我們?yōu)槭裁匆樘?RNA?是為了后面的實(shí)驗(yàn),例如原位雜交,免疫沉淀等等。所以,一定要明確后面到底是要干嘛?cDNA 文庫(kù)構(gòu)建要求 RNA 完整而無(wú)酶反應(yīng)抑制物殘留;Northern 對(duì) RNA 完整性要求較高,對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低;RT-PCR 對(duì) RNA 完整性要求不太高,但對(duì)酶 反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。不用每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的,從而造成不必要的浪費(fèi)。


    綜上所述,對(duì)大部分實(shí)驗(yàn)者來(lái)說(shuō),RNA 抽提比 DNA 抽提要困難得多。所以,我們要個(gè)個(gè)牢記,三大紀(jì)律八項(xiàng)注意。

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