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    【干貨】RNA抽提原理和流程

    發(fā)布時(shí)間: 2021-08-30  點(diǎn)擊次數(shù): 6089次

    現(xiàn)在我們所熟知的 TRIzol 是 Life Technologies 公司的商品名,而同樣的試劑在 Piotr  Chomczynski 創(chuàng)辦的 MRC 公司則被命名為 RNAzol(據(jù) Piotr Chomczynski 透露,他們已經(jīng)將 RNAzol 改進(jìn),使抽提得到的 RNA 無基因組 DNA 殘留)。事實(shí)上,這種 RNA 抽提的方法應(yīng)該叫做“異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法"


    TRIzol 作用原理: 

    在勻質(zhì)化或溶解樣品中,TRIzol 試劑可保持 RNA 的完整性,同時(shí)能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入氯仿離心后,裂解液分離成水相和有機(jī)相。RNA 存在于水相。水相轉(zhuǎn)移后,RNA 通過異丙醇沉淀回收。移去水相后,用乙醇沉淀可從中間相得到 DNA,加入異丙醇沉淀可從有機(jī)相得到蛋白質(zhì)。


    需自備的耗材試劑: 

    o RNase free 的一次性帶蓋透明聚丙烯管 

    o RNase free 的槍頭 

    o RNase free 玻璃瓶:玻璃瓶 200°C 烘烤 2h 即可去除 RNase,塑料瓶蓋可浸泡 10 分鐘 的 0.5 M NaOH 溶液,然后用 RNase free 水*沖洗,并高壓蒸汽滅菌。 

    o 氯仿 

    o 異丙醇 

    o RNase free 水:即 DEPC treated 水。把水加入 RNase-free 玻璃瓶中,加入 0.1%(v/v) DEPC 用力搖勻,37°C 過夜,高溫高壓滅菌。滅菌時(shí)瓶口需擰松,DEPC 受高溫會(huì)分解出大量 CO2,注意安全! 

    o 75%乙醇(無水乙醇溶于 RNase free 水中)


    簡(jiǎn)明抽提流程: 

    裂解 

    a) 新鮮取材的組織液氮急凍后,每 50-100mg 組織加 1ml TRIzol,使用強(qiáng)力勻漿機(jī)勻漿;

    b) 貼壁細(xì)胞則棄培養(yǎng)基后每 87.5px 皿中加入 TRIzol 試劑 1ml 吹打裂解; 

    c) 懸浮細(xì)胞則離心沉淀細(xì)胞棄培養(yǎng)基,每 5-10×106 個(gè)細(xì)胞中加入 1ml TRIzol 吹打裂解。

    Tips:使用 TRIzol 試劑前避免洗滌組織和細(xì)胞,因?yàn)檫@增加了 mRNA 降解的可能性。

    ↓ 

    室溫孵育 5-10min 

    ↓ 

    每 1ml TRIzol 中加 200ul 氯仿,用手大力搖管 15s, 室溫孵育 2-3min 

    ↓ 

    2-8°C、12000 g×15min


    離心后,混合物分離為下層紅色的酚-氯仿相、中間相以及上層無色水相。RNA 存在于水相。

    ↓ 

    轉(zhuǎn)移水相到一個(gè)新管,加入 500ul 異丙醇上下顛倒混勻,室溫孵育 10min 

    Tips:轉(zhuǎn)移水相時(shí),槍尖隨著液面下移而下移,避免擾亂分層,慢慢吸取,避免吸到中間相和下層有機(jī)相,更不要貪心吸太多,吸大約 400ul 就好。 

    2-8°C、12000 g×10min 往往離心前 RNA 不可見,離心后再管側(cè)面和底部形成白色沉淀 

    棄上清,1ml 75%乙醇洗滌一次,2-8°C、7500 g×5min

    Tips:加入 75%乙醇時(shí)輕輕加進(jìn)去就好,盡量不要把 RNA 沉淀吹散,把沉淀保持在原位最好了,因?yàn)橛袝r(shí)候 RNA 太少,吹散了再離心下來時(shí) RNA 碎片不一定能聚集到一起形成肉眼可見的沉淀,導(dǎo)致后面的“盲操作"。而不小心吹散的話也沒關(guān)系,對(duì) RNA 質(zhì)量不會(huì)有影響。

    盡量吸除上清,室溫干燥 5-10min,以 RNase free 水溶解,并保存于-70°C 

    Tips:密切注意 RNA 沉淀的干燥程度,不要*干燥,這將大大降低其溶解度。部分溶解的 RNA 其 A260/280 比值會(huì)偏低。最佳干燥度為 RNA 沉淀仍然是白色的,微微濕潤(rùn)呈啫喱狀。


    OK,搞定!

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