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    90%的人在進行細胞轉(zhuǎn)染實驗時,幾乎忽略了這6點注意事項!

    發(fā)布時間: 2021-11-25  點擊次數(shù): 1893次

    轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術(shù)。分為

    物理介導方法電穿孔法、顯微注射和基因槍;

    化學介導方法:如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導的技術(shù);

    生物介導方法:有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細胞轉(zhuǎn)染方法,應該具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。病毒介導的轉(zhuǎn)染技術(shù),是目前最高轉(zhuǎn)染效率的方法,同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。


    但是病毒轉(zhuǎn)染方法的準備程序復雜,常常對細胞類型有很強的選擇性,在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉(zhuǎn)染方法,則各有其特點。需要指出的一點,無論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù),要獲得*的轉(zhuǎn)染結(jié)果,可能都需要對轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多,從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài)到轉(zhuǎn)染方法的操作細節(jié)。下面列舉一些影響因素。


    90%的人在進行細胞轉(zhuǎn)染實驗時,幾乎忽略了這6點注意事項!



    1、血清





    A、DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物形成時不能含血清,因為血清會影響復合物的形成。


    B、一般細胞對無血清培養(yǎng)可以耐受幾個小時沒問題,轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加,但血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對條件進行優(yōu)化。


    C、對于對血清缺乏比較敏感的細胞,可以使用營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基,或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞,建議使用專用轉(zhuǎn)染試劑。有條件的話,可以用無血清培養(yǎng)基代替PBS洗細胞兩遍,注意洗的時候要輕,靠邊緣緩緩加入液體,然后不要吹吸細胞,而是轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板讓液體滾動在細胞表面。如果洗的太厲害,細胞又損失一部分,加了脂質(zhì)體后,細胞受影響就更大了,死亡細胞會增多。



    2、抗生素(PS)





    抗生素,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素,甚至在準備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用抗生素。這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,ICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。



    3、細胞狀態(tài)





    這點非常重要,不要急于求成,一定要讓細胞處于最佳的生長狀態(tài)再做。有文獻說傳代不要超過17代。細胞復蘇后的3代左右時細胞狀態(tài)最好,不要用傳了很多代的細胞去做,細胞的形態(tài)都會發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化,融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉(zhuǎn)染活性。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復最佳結(jié)果。或者,幾種來源于經(jīng)篩選,轉(zhuǎn)染效率較高細胞亞系的細胞系現(xiàn)在有售。



    4、細胞鋪板密度





    用于轉(zhuǎn)染的最佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對細胞有毒害作用,細胞太少,容易死。一般轉(zhuǎn)染時,貼壁細胞密度為70%-90%,懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml,確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細胞密度很敏感,所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。細胞的融合度必須要達到90%才能做。



    5.啟動子的選擇





    獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性。同其他啟動子,如SV40和RSV(勞斯肉瘤病毒)相比,在BHK-21中其活性最高。這三種病毒啟動子在T細胞來源的細胞系,如Jurkat中組成表達水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細胞中CMV啟動子,而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高,因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。



    6、DNA量





    高質(zhì)量的DNA對于進行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒一定純度好、濃度高、無內(nèi)毒素。濃度不要低于0.35ug/ul。產(chǎn)物表達,48小時mRNA表達最高;72h蛋白表達最高。


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